주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy)에서 Immunolabling의 적용
제공 : Dr.김수진
주사전자현미경은 물체의 절단면 미세구조를 관찰하기 위한 목적에서 제작된 현미경이다. 따라서 관찰하기위한 과정은 무생물 즉 유기물이나 금속의 경우는 금속입자를 鍍金하여 관찰하거나 아니면 금속의 경우 직접 관찰하고, 생물체의 경우는 고정, 탈수, 건조, 鍍金 그리고 관찰하는 것이 일반적으로 사용되어 왔다.
그러나 1970년대 말부터 전자현미경의 생물시료에 면역항체를 이용하여 금속입자를 표지하고 단백질의 세포내 존제와 분포 및 이동경로를 확인하는 방법이 계발되어 투과전자현미경에 적용되어 왔다. 1980년대 부터 주사전자현미경에도 이방법이 적용되어 세포의 표면에 물질의 존제와 분포 및 이동경로를 확인하는 방법으로 현재 많이 사용되고 있다.
특히 최근에는 세포배양기술이 발달되면서 배양세포의 표면미세구조의 관찰에 쉽게 적용 시킬 수 있으므로 많은 연구자들이 면역표지법에 특히 관심이 있다. 따라서 많은 연구자들이 SEM의 Immunolabling technique을 적용시키고 있는 것으로 알고 있다. 혹자들은 SEM과 TEM의 Immunolabling technique을 Immunoelectron Microscopy으로 사용하기도 하고 심한경우에는 면역전자현미경학이라고 까지 할 정도가 되었다. 그러나 본인의 생각으로는 전자현미경의 관찰에서 한가지 방법에 불과한 것을 전공학문으로 승격함은 다소 무지한 표현으로 여겨지며 Immunoelectron Microscopic technique(method) 혹은 Electron Microscopic Immunolabling technique(method)로 사용함이 정확할 것으로 생각한다.
아무튼 주사전자현미경 면역표지법은 현제까지 사용되어왔던 면역반응, 고정, 탈수, 건조 및 도금을
적절이 시도해야 하므로 다음과 같은 시약으로 시료의 처리과정을 사용함이 적절 할 것으로 생각 된다.
1. 표지에 사용되는 시약
1) 0.12 M cacodylate buffer(pH 7.4)에서 1% paraformaldehyde와 1% glutaraldehyde
2) 0.12 M cacodylate buffer(pH 7.4)에서 2% osmium tetroxide 고정액
3) 50nm protein A gold particle
A. Colloidal gold solution
D.D.H2O 79ml
1% HAuCl4 in H2O 1ml
1% tri-sodium citrate 2H2O 5ml
1% tannic acid 0.005ml
25mM K2CO3 0.005ml
final volume 100ml by H2O on the hot plate(60℃).
while stirring. Boiling until red color appear.
B. Protein A-gold complex
Colloidal gold solution 100ml
Protain A solution(2mg/ml) 1ml
10,000g 정도의 원심분리로 분리시켜 사용
4) 2차항체 반응 산도에 대한 비교표
Protein pH
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Immunoglobulins(IgG fraction, affinity-purified antibody, 9.0(7.6-8.2) monoclonal antibodies)
F(ab1)2 7.2
Protain A and G 5.9-6.2
Ricinus communis lectin Ⅰ and Ⅱ 8.0
Peanut lectin 6.3
Helix pomatia lectin 7.4
soybean lectin 6.1
lens cularis lectin 6.9
Bandeorea ismplicifolia lectin 6.2
Mannan from candida utilis or sacharomyces cerevisae 7.0
Horseradosh peroxidase 7.2-8.0
Ovomucoid 4.8
Ceruloplasmin 7.0
Asialofetuin 6.0-6.5
Galactosyl bovine serum albumin 6.0-6.5
Bovine serum albumin 5.2-5.5
Peptide-bovine serum albumin conjugates 4.0-4.5
Insulin-bovine serum albumin conjugates 5.3
Chokera toxin and Tetanus toxin 6.9
DNA ase 6.0
RNA ase 9.0-9.2
Low density lipoprotain 5.5
α2-macroglobulin 6.5
Avidin(unmodified, egg white) 10.0-10.6
Avidin(tetramethyrhodamine isothio-cyanate, egg white 6.4-6.6
avidin(Steptavidin)
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2. IMMUN SEM을 위한 과정
1) 면역반응
배양세포 혹은 조직세포를 세척용 완충용액으로 세척을 하고 2차면역항체에 따라 완
충용액의 pH를 다르게하여 세척한다.
37도의 온도에서 1차 면역항체와 1시간 반응 시킨다.
4도의 온도에서 5분씩 3회 세척용 완충용액으로 세척
20도의 온도에서 2차면역항체와 1시간 반응
4도의 온도에서 5분씩 3회 세척용 완충용액으로 세척
2) 시료의 고정
20도의 온도에서 1차고정액으로 5분 고정한 다음 4도의 온도에서 2시간 고정한다.
4도의 온도에서 5분씩 3회 세척용 완충용액으로 세척
4도의 온도에서 2차 고정액으로 1시간 고정한다.
4도의 온도에서 5분씩 3회 세척용 완충용액으로 세척하여 탈수 한다.
3) 탈수
탈수에서 aceone을 사용할때는 배양세포의 겨우 배양용기가 aceone에 녹지 않는 것
을 사용하거나 배양세포를 배양용기에서 탈락시켜 원심분리하여 사용함이 이상적
이다.
4) 건조
조직세포는 일반적인 방법으로 건조시킬 수 있으나 배양세포의 경우에는 거름종이에
포장하여 건조시키는 것이 효율적이다.
* 건조과정에서도 시료의 변형을 최소로 줄여야하며 시료의 성질에 따라서 air
drying, vacuum freeze drying, critical point dry 등의 방법을 선택하여 시행하
는 것이 좋다.
5) 시료대에 부착
조직혹은 배양세포를 시료대(spcimen stub)에 고정(mounting) 시킬때에는 접착제를
사용하는 것 보다 시료대 부착용 탄소 양면tape등을 사용하는 것이 효율적이다.
6) 도금(Coating)
일반적으로 많이 사용하는 RMC-Eiko Corp.Ion Coater 등을 사용함이 무난하다.
7) 현미경관찰후 사진은 사진입자의 선명도를 유의하여야 표지된 금속입자의 확인이
명확해진다.